Pentoz Fosfat Yolunun Önemi Nedir? - Pentoz Fosfat Yolu

[theking]

Klinik Önemi
6-Fosfoglukonat dehidrogenazın defektif varyantları, ilk olarak 1964 yılında Brewer ve Dern tarafından, siyah bir Amerikan ailesinde tanımlamış ancak fertlerde hemolitik anemi saptanmamıştır. Enzim eksikliği sonucu oluşan kronik hemolitik anemi vakaları ise daha sonraki yıllarda rapor edilmiştir. Biyokimyasal analizler 6-PGD eksikliğinin sessiz PGD0 allelinden kaynaklandığını göstermektedir.

Pentoz fosfat yolunun ilk enzimi olan glukoz-6-fosfat dehidrogenaz (G-6-PD)' nin insan eritositlerini Plasmodium falciparum enfeksiyonuna karşı koruduğu bilinmektedir. Aynı şekilde eritrosit 6-PGD-A' sı ve fosfoglukomutaz gibi enzimlerin değişik fenotiplerinin malaryaya karşı koruma sağladığı gösterilmiştir.

Enzim eksikliği hücrede 6-fosfoglukonatın (6-PG) birikmesine, fosfoglukoz izomerazın ve glukoz metabolizmasının tümüyle inhibe olmasına bağlı olarak toksik etki yaratmaktadır. Bu nedenle kemoterapilerde hedef enzim olarak yararlanılabilir.

6-Fosfoglukonat dehidrogenaz, G-6-PD ve malik enzim gibi NADPH üretiminden sorumlu enzimler ile hidroksi-metilglutaril-CoA redüktazın gen ekspresyonunun artması, kolesterol sentezinin artmasına, dolayısıyla hiperkolesterolemiye neden olmaktadır. Hiperkolesteroleminin hem renal bozukluklara hem de arterosklerozise yol açtığı bilinmektedir.

Alzhemier hastalığında, inferior temporal korteks tabakasında, G-6-PD ve 6-PGD'nin belirgin artışı gözlenmiştir. Pentoz fosfat yolu enzimlerinin aktivitesindeki bu yükselme hücrede artan prooksidan aktivitesine cevap olarak meydana gelmektedir.

Yapısal Özellikleri
Amino asit bileşimi: 6-Fosfoglukonat dehidrogenazın amino asit dizisi 20 farklı türde belirlenmiş; iki tür için ise kısmi amino asit dizisi ortaya çıkarılmıştır. Genellikle, enzimler arasındaki en önemli farklılık C-ucunda ortaya çıkar, koyun karaciğeri enzimi bu bölgede iyi korunmuş glisin-serin dizisi içerirken 'Escherichia coli ve Trypanosoma brucei'den elde edilen enzimin C-ucunda bu diziler bulunmamaktadır.

Lactococcus lactis, Trypanosoma ve koyun karaciğeri 6-PGD'sinin amino asit dizilimleri, substrat bağlanma bölgesinde bu üç tür için aynı olmasına rağmen, koenzim bağlanma bölgesinde farklılık gösterir. Tüm türlerde korunmuş olan Lys-183 substratın 3-OH grubu ile, Arg-446 ise 6-fosfat grubu ile ilişkilidir. Genel olarak arjinin (Arg-34), NADP+'nin 2-fosfat grubu ile bağ yaparken, Bacillus subtilis 6-PGD'sinde tirozin bağlanmada rol oynamaktadır.

Enzimin aktif merkezinde yer alan histidinin iyonizasyonu enzimin substrata, tirozinin iyonizasyonu ise koenzime bağlanmasını etkiler. Yaşlanmayla birlikte hücrede artan oksidatif stres, özellikle lizinler üzerinde çeşitli modifikasyonlara neden olarak enzimin aktivitesinde düşüş meydana getirir.

Molekül Ağırlığı ve Altbirim Yapısı: 6-Fosfoglukonat dehidrogenaz, molekül ağırlığı 80.000-120.000 Da arasında değişiklik gösteren homodimerik bir proteindir. Enzim başlıca büyük bir -heliks ile paralel ve antiparalel beta tabakalı yapıdan oluşur. Altbirimler fonksiyonel olarak asimetriktir. Enzimin bir ünitesinde meydana gelecek konformasyonel değişimin, diğer ünitenin koenzime bağlanmasını engelleyerek, inaktif olmasını sağladığı gösterilmiştir.

Saflaştırılması
Enzim memeli dokusundan ilk olarak Villet ve Dalziel tarafından koyun karaciğerinden DEAE selüloz, CM-selüloz gibi iyon değiştirici kromatografiler ve amonyum sülfat çöktürmesi gibi yöntemler kullanılarak %20 verimle 600 kez saflaştırılmıştır. Daha sonra yapılan bir çalışmada, amonyum sülfat çöktürmesi yerine ultrafiltrasyon yöntemi kullanılarak aktivite kaybının minimuma indirilebileceği bildirilmiştir. 6-PGD DEAE-Sephadex, CM-Sephadex, hidroksiapatit ve NADP+-Sepharose, NADP+-Agaroz, Matriks Jel Red-A, Procion Blue HE-GN ve PHE-Resource kolon kromatografileri ile saflaştırılmıştır. G-6-PD ve 6-PGD'nin birlikte saflaştırmasında ise 2,5-ADP-Sepharose 4B affinite ve DEAE-Sepharose Fast Flow iyon değiştirici kolonları kullanılmıştır. Bu iki enzim DEAE-Sepharose Fast Flow iyon değiştirici kolonundan tuz gradienti ile elüe edilmiştir.

Enzimin stabilitesini sağlamak için tüm saflaştırma basamakları +4 C de yapılmakta ve tamponlara 1mM EDTA ve 1Mm-merkaptoetanol, NADP+, fenilmetilsulfonil florür ilave edilmektedir